los phd-fingers de chd5 reconocen específicamente cola n-terminal no modificada de la histona h3. ...

Los PHD-fingers de CHD5 reconocen específicamente cola N-terminal no modificada de la histona H3.

Chip y micro array de CHD5

CHD5 es blanco directo de miR-211. La sobreexpresión de miR-211 promueve el crecimiento de las células tumorales al menos en parte por la reducción de la expresion de CHD5.

Las mutaciones somaticas adquiridas del gen CHD5 son poco frecuentes en neuro-blastoma y la inactivación se por deleción y/o metilación del promotor.

En NB, la expresión de CHD5 y la metilación de su promotor están asociados a la amplificación de MYC.

La elevada expresión de CHD5 está fuertemente correlacionada con la evolucion favorable del NB.

La reducción de la expresión de CHD5 mediada al menos por metilación de su promotor contribuye al desarrollo y la progresión del cancer de mama.

La reducida expresión de CHD5 es un marcador prognostico negativo en cancer de vesícula primario.

CHD5 es un importante supresor tumor (TSG) en Endometriosis.

En cancer de pulmón, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.

En cancer gástrico, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.

hsa-mir-1202 aprareció con 4 reads en 3 experimentos de deep sequencing en squamous cell.

hsa-mir-1203 aprareció con 1 read en 1 experimento de deep sequencing en cervix normal.

has-mir-1201 sería un snoRNA.

Últimos avances PCR

Detección de los miRNAs 1201, 1202 y 1203

Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs.

Detección del ARNm de CHD5 Detección de CHD5

Caracterización del niveles de expresión de CHD5.

Alteración de los niveles de los miRNAs

Respuesta en los cultivos celulares Respuesta en la expresión de CHD5 Especificidad de la regulación de los miRNAs

Respuesta en la expresión de genes regulados por CHD5:P53p19

Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs en muestras de pacientes con LLC

Caracterización del niveles de expresión de CHD5 en muestras de pacientes con LLC

PCR PCR

real time PCR real time PCR

western blot

inmunoprecipitación

transfección con oligos sintéticos sense y anti-sense

apoptósis

viabilidad

western blot

northern blot

inmunofluorescencia

western blot

luciferasa

Estrategia

Proyecto

Análisis de las semillas en el 3’UTR de CHD5

real time PCR

real time PCR

1203 sh, 1203HeLa, C- 12031201 sh, 1201 HeLa, C- 12011202 sh, Ladder, 1202HeLa, C- 1202CHD5 set1, C- set1 GAPDH sh, GAPDH HeLa, C- GAPDH

Detección de miRNAs PCR

1) ARN total , tejido neural de rata2) ARN total, Jurkat3) ARN total, Daudi4) ARN total, SKN-AS5) ARN total, SKN-BE2.FastRuler DNA Ladder High Range, Fermentas (#SM1128).

Detección ARNm CHD5

Northern-blott

PCR

Detección ARNm CHD5

PCR tiempo real

Set1 Set2 Set3 Set1 Set2 Set3

SHSet 1: Comprende sólo 1 exon

Set 2: Levanta CHD3

Set 3: El indicado

Abcam Santa Cruz

0,15 % tween 0,15 % tween

75 µg beads 75 µl beads

2 µg Anticuerpo 2 µg Anticuerpo

500 µg proteína 500 µg proteína

Detección CHD5 Inmuno-precipitación

Control

1203 AS1202 AS1201 AS

1203 S1202 S1201 S

Lipofectamina 2000

Transfecciones de los miRNAs SK-N-SH

SK-N-SH50 nM de miARNs2 ml/ml de lipofectamina

Transfecciones de los miRNAs SK-N-SH

HeLa50 nM de miARNs2 ml/ml de lipofectamina.

Transfecciones de los miRNAs HeLa

Viabilidad en HeLaCristal violeta

Viabilidad celular

Efecto de los miRNAs

Controles SenseAnti-sense

--

XX

+

+

HeLaCitometría de flujo24 horas post-transfección.

Apoptósis


X

+

+

+

-

X

Control

1203 AS1202 AS

1201 AS

M2

M3

M4 M5

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch

All 0, 255 43318 100.00 86.64 115.29 108.75 34.27 101.00 84

M1 0, 67 1123 2.59 2.25 41.47 37.23 41.72 43.00 67

M2 69, 105 22358 51.61 44.72 88.54 88.17 9.21 87.50 84

M3 106, 144 9266 21.39 18.53 123.15 122.61 9.41 122.00 106

M4 144, 178 7644 17.65 15.29 159.83 159.57 5.80 160.00 160

M5 179, 255 3088 7.13 6.18 204.65 203.55 10.53 198.00 179

File: sh2_22.9.09.001 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: control Patient ID:

Tube: Panel:

Acquisition Date: 22-Sep-09 Gate: G1

Gated Events: 43318 Total Events: 50000

X Parameter: FL2-A (Linear)



All 0, 255 10708 100.00 43.40 101.56 92.43 41.14 90.00 81

M1 0, 63 1270 11.86 5.15 41.61 38.06 37.51 44.00 62

M2 63, 100 5110 47.72 20.71 81.58 81.08 10.96 81.00 81

M3 101, 136 2134 19.93 8.65 117.56 117.08 9.07 117.00 101

M4 136, 170 1703 15.90 6.90 150.70 150.42 6.05 150.00 152

M5 171, 255 591 5.52 2.40 203.40 202.03 11.69 202.00 172


Sample ID: 12O1 Patient ID:

Tube: Panel:




M2

M3

M4 M5

M2

M3

M4 M5



All 0, 255 27386 100.00 65.91 109.92 102.67 35.69 98.00 82

M1 0, 65 1465 5.35 3.53 40.66 37.15 38.69 41.00 64

M2 65, 106 14473 52.85 34.83 86.97 86.50 10.44 86.00 82

M3 108, 143 5319 19.42 12.80 124.82 124.36 8.59 125.00 108

M4 143, 174 4500 16.43 10.83 156.95 156.72 5.43 156.00 159

M5 177, 255 1488 5.43 3.58 203.02 201.93 10.51 197.50 179



Tube: Panel:






All 0, 255 40264 100.00 84.38 113.38 106.15 35.12 102.00 84

M1 0, 69 2149 5.34 4.50 44.00 39.91 39.46 45.00 69

M2 69, 106 19958 49.57 41.83 88.82 88.40 9.79 88.00 84

M3 108, 147 9242 22.95 19.37 125.95 125.39 9.51 125.00 108

M4 147, 178 6319 15.69 13.24 160.52 160.30 5.25 160.00 159

M5 177, 255 2706 6.72 5.67 203.52 202.41 10.63 198.00 177



Tube: Panel:




M2

M3

M4 M5

2.59

5.34

11.86

5.35

Series10

102030405060708090

100

% Viabilidad

1201 AS 1202 AS 1203 AS Control

Apoptósis


0

2

4

6

8

10

12

14vi 1201

CemBatspMHh1ksqlHVWWcU

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18vi 1202

35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW 35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW

0

2

4

6

8

10

12

14

16vi 1203

VA5Gvo53SR6QbLi7m6hgob

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45vii 1202

UeQG8KAgyJXc5Ez745OVX4

0

5

10

15

20

25

30

35vii 1201

qDMsxZOdzfy79OVHZAchTV

0

5

10

15

20

25

30

35vii 1203

l1VOM9efqfxJ9rT2Q6fFhQ

Regulación de CHD5 Luciferasa

X

+

-

12011203

12011202

X

X

-+

+

-

+ +X

0

2

4

6

8

10

12viii 1201

3XtPSheUss1CqeWTPf7uwM

0

5

10

15

20

25

30viii 1202

b00Z59TMTNynKMZClxJ9Wn

0

2

4

6

8

10

12viii 1203

VGwIDpDjIAUvjItO49vxxk

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45v0 1201

pGc0hYDIhaNNX3vghCyYk6

05

101520253035404550

v0 1202

m8mKGsIt2sRgxNCRZfgKbQ

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45v0 1203

ODhSnzYuVxrjj4ExhbZN7l


12021202

Sin inserto

X

+

+-

-

X

++

X

-

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

vi 1201


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

vi 1202

35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

vi 1203


0

2

4

6

8

10

12

14vi 1201


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18vi 1202

35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW 35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW

0

2

4

6

8

10

12

14

16vi 1203


X

+

-

12011203

-+

+

+

X

+ +

X

X

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

vii 1202


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

vii 1201


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

vii 1203


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45vii 1202


0

5

10

15

20

25

30

35vii 1201


0

5

10

15

20

25

30

35vii 1203


12011202

X

X

-

+ +X

+-

X

X

--

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

viii 1201


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

viii 1202


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

viii 1203


0

2

4

6

8

10

12viii 1201


0

5

10

15

20

25

30viii 1202


0

2

4

6

8

10

12viii 1203


12021202

+

+-

X

++

X

+

+

+

X

X +

+

X

X


Sin corrección por V0

I (1201 - 1203)

II(1202 - 1201)

III(1202 - 1202)

1201s + X X

1201as X X -1202s + - -1202as + + +1203s - X X

1203as - + +

Con corrección por V0

I (1201 - 1203)

II(1201 - 1202)

III(1202 - 1202)

1201s + - X

1201as X X X

1202s + - +1202as X X X+1203s + - +1203as X + X+

CHD5 3’UTR (nt 1017-1023) 5’ ...GCCUACCCUGCCCACCUCCGGAG...

|||||| miR-1203 3’ CUCGACGUAGGACCGAGGCCC

CHD5 3’UTR (nt 1314-1338) 5' ACGGAG-ATGGGGAGCAGGTCAGGCC 3' :||| ||| | ::||||||

miR-1201 3' AGTCTCGTACAC--AAATTAGTCCGA 5'

CHD5 3’UTR (nt 1863-1869) 5' ...GCUCUGCGGUGCCUCCUGGCAAA... ||||||

miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG

CHD5 3’UTR (nt 2087-2093) 5’...CUGUGCGCCUUCCUCUCAGGCAG...

|||||| miR-1201 3’ AGUCUCGUACACAAAUUAGUCCGA

CHD5 3’UTR (nt 3020-3026) 5‘ ...UGGGUGGGGGCCGAGGCUGGCAC... |||||||

miR-1202 3‘ GAGGGGGUGACGUCGACCGUG

CHD5 3’UTR (nt 3448-3454) 5' ...CAGGCACAGCCCCAG----GCUGGCAA... ||||| |||||||

miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG

psiCHECK-2_1/3 (i)

psiCHECK-2_1/2 (ii)

psiCHECK-2_2/2 (iii)

No RNA /irrele-vant RNA

1201s/1201as 1202s/1202as 1203s/1203as

s 100 91.9494976920988

73.5541677979908

78.8623404833017

as 94.1080640781971

29.0659788216128

121.89790931306

73.6763508009774

1030507090

110130

SH

CHD5

expr

essio

n in

relati

on to

CHD5

ex

pres

sion i

n con

trl sa

mple

cC2Dzha1xXS2TA3hd1gpd5

No RNA /irrele-vant RNA

Lipofectamine treated, no RNA control / irrele-

vant RNA

1201s/1201as 1202s/1202as 1203s/1203as

s 100 106.988013261923

101.734251466463

230.017852588625

241.596531497067

as 35.3226217801581

35.322622 117.495536852843

115.863300178526

227.339964294822

2575

125175225275

HeLa

CHD5

expr

essio

n in

relati

on to

CHD5

ex

pres

sion i

n con

trl sa

mpl

e

1S9AxOYprBZjBZiP4yR7vX

Regulación de CHD5 Western Blot

CHD5 SH CHD5 HeLa

1201s - -1201as x -1202s + -1202as + -1203s + x1203as x +

Regulación de CHD5 Inmunofluorescencia

HeLa 48 horas post-transfeccion.50 nM de los oligonucleotidos sintéticos.Rabbit anti-CHD5 (santa cruz)Anti-Rabbit Alexa fluor 488.

Regulación de CHD5 Inmunofluorescencia

SH 48 horas post-transfeccion.50 nM de los oligonucleotidos sintéticos.Rabbit anti-CHD5 (santa cruz)Anti-Rabbit Alexa fluor 488.

p53

Gapdh

1203 12011202 1203 1202 1201Pool ASControl Pool S

AS S

Regulación de p53 Western Blot

WI38

VI 1201 1203

VII1202 1201

VIII12021202

VI 12011203

c

VII12011202

c

VIII12021202

c

Western CHD5 SH

Western CHD5 HeLa

Apoptosis HeLa

Viabilidad HeLa

Inmuno HeLa

InmunoSH p53

1201s + X X + - X - - X X + + +1201as X X - X X X X - + + + + +1202s + - - + - + + - - - + + +1202as + + + X X X+ + - + - + + +1203s - X X + - + + x X X + + +1203as - + + X + X+ x + + + + + +

Resumen

los phd-fingers de chd5 reconocen específicamente cola n-terminal no modificada de la histona h3. ...

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