EFECTO DE EXTRACTOS ETANOLICOS Y ACEITES ESENCIALES DEL OREGANO SILVESTRE (Lippia origanoides H.B.K.) Y MATARRATON

(Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) EN EL CONTROL DE LA GARRAPATA COMN DEL BOVINO Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE)

METODOLOGA

Elaboracin de extracto de organo silvestre (Lippia origanoides H.B.K.) Y matarratn (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers)

La obtencin de los EE se realizar utilizando la metodologa recomendada por Marcano y Hasegawa (2002). El material vegetal para la obtencin del EE consistir en 4 Kg de hojas frescas, aparentemente sanas y plenamente desarrolladas de organo silvestre y matarratn, las cuales se colectaran, en el primer caso de plantas silvestres localizadas en el Parque Nacional Terepaima, especficamente en terrenos aledaos al Decanato de Ciencias Veterinaria de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado

(UCLA) y en el segundo, de plantas ubicadas en la Estacin Experimental Dr. Manuel Salvador Ypez El Torrellero, finca perteneciente a la UCLA. Una vez en el

Laboratorio de Microtecnia e Histopatologa Vegetal del Posgrado de Agronoma, las hojas se colocaran, por separado, en sacos de malla, para favorecer la ventilacin y facilitar el secado y se cuelgan en cobertizo, para evitar la luz. Transcurridas 2 semanas, sern molidas en molino industrial y el polvo resultante se pesa, obtenindose un valor inicial en Kg.

Para macerar el polvo obtenido de las hojas, el mismo se coloca en tobos de plstico con etanol al 96%, en una proporcin de 1Kg de material vegetal molido/10 L de etanol, sta mezcla se deja reposar por 2 semanas. El lquido ser filtrado utilizando una gasa de cuatro capas y concentrado en un sistema de secado rotatorio al vaco (roto-vapor Brinkmam MR, Mod. RE111) a 100C. El extracto crudo concentrado obtenido, luego de la evaporacin del agua y etanol, ser recuperado utilizando el sistema de secado rotatorio y almacenado a 8 C hasta la evaluacin de las propiedades acaricidas, se guarda en un envase protegido de la luz, bajo refrigeracin, hasta el momento de la aplicacin de los tratamientos.

Extraccin del aceite de organo

Para la obtencin del AE del organo se usan hojas molidas y secas, se colocan en un equipo de destilacin. Inicialmente se obtiene el aceite + agua, concentrndose el primero en la parte superior de la mezcla, posteriormente, una vez terminado el proceso de destilacin, se separan ambos lquidos con la ayuda de un embudo de separacin. El aceite resultante se guarda en viales, protegido de la luz directa y bajo refrigeracin. En el caso del matarratn no se obtiene aceite esencial, segn ensayos previos con esta planta.

Determinacin y cuantificacin de metabolitos secundarios (MS) en extractos etanlicos de organo silvestre (Lippia origanoides H.B.K) y matarratn (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) por cromatografa en slica gel.

a. Determinacin cualitativa.

Utilizando cromatofolios de silica gel (TLC 60 F254) cortados a 6,5 x 2,5 cm; con la ayuda de una micropipeta se adicionan 10 L de los EE de ambas plantas distribuidos en 2 gotas a 1 cm de uno de los extremos del cromatofolio (Marcano y Hasegawa, 2002).

i. Alcaloides.

Se prepara la mezcla de solvente utilizando n-butanol+ cido actico + agua a una

proporcin de 9:2:1. Se agrega el solvente en la cmara para cromatografa, dejando correr el solvente hasta que ascienda 0.5 cm antes del extremo final del cromatofolio. Se revela la presencia del MS bajo lmpara de luz UV, la presencia de coloracin fluorescente-naranja es indicio positivo para este grupo de metabolitos.

ii. Flavonoides.

Dentro de la cmara para cromatografa se adiciona el solvente, el cual contiene una mezcla de benceno + cido actico + agua en una proporcin 12:7:2. Se colocan los cromatofolios dejndolo correr hasta 0.5 cm antes del extremo. Revelado bajo lmpara UV, el indicativo de la presencia estos MS sera la aparicin de una coloracin blanca-

verdosa.

iii. Fenoles.

Para la determinacin de fenoles se prepara el solvente, mezclando agua + cido

actico a una proporcin de 9:1. Colocando los cromatofolios en la cmara de cromatografa, se dejan igualmente correr hasta 0.5 cm antes del final de la placa. Se realiza el revelado con una solucin de cloruro frrico al 1%, la aparicin de una coloracin parda oscura es el indicativo de la presencia de estos MS en el cromatofolio. Todo el procedimiento se hace dentro de la campana de flujo laminar.

iv. Saponinas.

Se diluyen 5 ml del EE en 5 ml de agua destilada, manteniendo una relacin 1:1, se agita vigorosamente durante 1 min. Posteriormente, ocurre la formacin de espuma y si sta es persistente durante 15 minutos, se considera positiva la prueba para este grupo de MS.

v. Aceites esenciales.

Se determina por los aromas caractersticos que le proporcionan este grupo de MS al extracto etanlico.

b. Determinacin cuantitativa.

Para la cuantificacin se utiliza la metodologa planteada por Vsquez et al. (2008) se utilizan los mismos cromatofolios usados en las corridas cromatogrficas, a las cuales se les determin los grupos de MS presentes en los EE de organo silvestre y matarratn

almacenados a 8 y 26C. Siendo positiva la presencia del MS en el cromatofolio, se procede a marcar el rea ocupada por el metabolito. Con un sacabocado afilado se

extraen tres secciones, las cuales se raspan y luego se pesan en una balanza analtica Ohaus Adventure N AR2140, se utiliza para calcular el peso (g) de cada MS. Este primer material pesado es la silica gel, correspondiente a lo que se llama rea conocida (AC); esta contiene MS + slica + solvente. Lo restante de la marca igualmente se raspa y se anota como rea desconocida (AD), contiene de igual modo MS+silica+solvente. Posteriormente se procede a sacar tres discos con el sacabocado

en el cromatofolio correspondiente al control, los cuales se raspan y pesan denominndose como el rea control (ACt), la cual contena slica + solvente. Para

conocer la concentracin de metabolitos secundario en mg mL-1 se emplea la siguiente

frmula.

/ = + 1000 1000

L10

Donde los 10 L representan la cantidad de extracto que se agrega a cada cromatofolio.

Evaluacin de extractos etanlicos y aceite esencial de organo silvestre (Lippia origanoides H.B.K) y matarratn (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) sobre la garrapata Rhipicephalus microplus.

Para la evaluacin de los EE y AE de organo silvestre y matarratn se usarn teleoginas (hembras adultas ingurgitadas) de R. microplus de 6 a 9 mm de largo, obtenidas directamente de la piel de la regin inguinal de bovinos de una finca. Se

transportan en envases de plstico con tapa agujereada; identificados y colocados en cavas con hielo para su procesamiento en las siguientes 24 h. Las teleoginas colectadas

se identifican y se seleccionan aquellas que estn vivas y sin daos, luego se lavan con agua corriente en un colador de acero inoxidable, se secan con papel absorbente y se pesan individualmente en una balanza electrnica. Se distribuyen en placas de Petri grupos de diez garrapatas/placa con un peso homogneo por grupo.

Se utilizarn los EE de L. origanoides y G. sepium a las concentraciones: 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5% y 1,25%, disueltos en agua destilada. Asimismo, el aceite esencial de L. origanoides obtenido se emulsiona por agitacin en agua destilada y se preparan las concentraciones al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,06%. Se aplica el test de inmersin de adultos de Drummond et al. (1973), en el cual se usan dos grupos de 10 garrapatas por cada concentracin ms un grupo control, que consistir en seis grupos de 10 garrapatas no tratadas. Los especmenes se incuban a 26 C 85% HR en cabinas de vidrio por 18 d, colocados en bandejas de vidrio y pegadas con cinta adhesiva de manera que el producto ovipositado pueda ser colectado, pesado, transferido a tubos de ensayo e incubado nuevamente por 25d hasta obtener las larvas. Una vez eclosionados los huevos se diferencian las larvas y los huevos no eclosionados, para obtener el porcentaje de eclosin por el mtodo visual.

En todos los casos, cada concentracin se probar por separado, en ningn momento se

mezclarn ni se repetirn pruebas de inmersin con extractos distintos. A continuacin se describen los grupos experimentales y el control.

Tabla 1. Concentraciones y grupos de garrapatas usados para la prueba de inmersin de

adultos con Extractos etanlicos de Lippia origanoides y Gliricidia sepium

CONCENTRACIONES EE Lippia origanoides EE Gliricidia sepium

20% n=10 n=10 n=10 n=10

10% n=10 n=10 n=10 n=10

15% n=10 n=10 n=10 n=10

5% n=10 n=10 n=10 n=10

2,5% n=10 n=10 n=10 n=10

1,25% n=10 n=10 n=10 n=10

n= nmero de garrapatas por grupo o repeticin

Tabla 2. Concentraciones y grupos de garrapatas usados para la prueba de inmersin de

adultos con Aceite esencial de Lippia origanoides

CONCENTRACION Aceite esencial Lippia

origanoides

Control/ agua

destilada

2% n=10 n=10 n=10

1% n=10 n=10 n=10

0,5% n=10 n=10 n=10

0,25% n=10 n=10 n=10

0,125% n=10 n=10 n=10

0,06% n=10 n=10 n=10

Determinacin de parmetros reproductivos en R. microplus

Con los datos del peso de las garrapatas, el peso de la masa total de huevos producidos

por garrapata y el porcentaje de eclosin, se calcula la eficiencia reproductiva (ER), valor que expresa la capacidad de una teleogina para transformar su peso corporal en

larvas viables, de acuerdo a la frmula siguiente (Drummond et al., 1973):

Peso de los huevos

ER = ________________________ x % Eclosin

Peso de las garrapatas

La eficacia o porcentaje de control se calcula en los grupos sometidos al test de inmersin de adultos, segn la frmula de Abbott la cual expresa el porcentaje de control parasitario (Abbott, 1925):

ER control- ER tratado

Eficacia = _____________________ x 100

ER control

Determinacin de porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus.

Se utilizarn 30 garrapatas R. microplus adultas ingurgitadas para obtener la masa de huevos tras su incubacin por 18 das a 26 C 85% HR en cabinas de vidrio. Ser recolectada en tubos de ensayo y llevadas a incubacin nuevamente bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad por 21 das. Luego de la eclosin de los huevos se dejan madurar las larvas por 14 das. Utilizando cpsulas de Petri con papel filtro adosado en el fondo, se realizarn 2 grupos experimentales, con seis concentraciones distintas, un grupo con extracto etanlico (EE) de L. origanoides y otro con EE de G. sepium en dos repeticiones de cada concentracin, haciendo un total de diez (10) preparaciones por cada extracto, ms cuatro cpsulas que contienen papel filtro para preparar el grupo control o sin tratamiento, el cual solo se le agregar agua destilada.

Se prepararn 20 ml de cada uno de los extractos a una concentracin del 20%, diluida en agua destilada. Se tomarn 10 ml de esta concentracin, diluyndola en forma sucesiva en partes iguales de agua destilada para obtener las siguientes concentraciones: 10%, 5%, 2,5%; 1,25%, 0,625%, 0,312% de cada extracto por separado. Asimismo, se prepararn 6 concentraciones del aceite esencial de L. origanoides y G. sepium emulsionado en agua destilada al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,12% y 0,06%. Con una pipeta automtica se impregnarn los papeles filtro, dentro de las cpsulas identificadas, con 1 ml de la concentracin correspondiente de cada tratamiento.

Posteriormente se colocarn sobre el papel filtro de 100 - 120 larvas por cpsula y se sella con cinta adhesiva de manera hermtica cada una, para evitar que escapen las larvas. El grupo control consiste en 4 cpsulas con agua destilada sin tratamiento en el papel filtro. Se introducen de nuevo en la cabina de incubacin por 24 horas para determinar el nmero de larvas vivas y muertas obtenido despus de los tratamientos de los EE y AE para obtener el porcentaje de mortalidad de las larvas en cada grupo al final de las 24 horas. Se considerarn larvas muertas aquellas que no caminan ni mueven sus patas. Se contar el nmero de larvas muertas por cpsula y el total de larvas por cpsula utilizando una lupa estereoscpica y pinzas entomolgicas.

Tabla 3. Concentraciones y grupos usados para la prueba de inmersin de larvas de

Rhipicephalus microplus con Extractos etanlicos de Lippia origanoides y Gliricidia sepium

Control: El grupo control consistir en cuatro grupos de 100 larvas cada uno con agua

destilada.

Tabla 4. Concentraciones y grupos usados para la prueba de inmersin de larvas de

Rhipicephalus microplus con Aceite esencial de Lippia origanoides.

CONCENTRACION/EE EE Lippia origanoides EE Gliricidia sepium

20% n=100 n=100 n=100 n=100

10% n=100 n=100 n=100 n=100

5% n=100 n=100 n=100 n=100

2,5% n=100 n=100 n=100 n=100

1,25% n=100 n=100 n=100 n=100

0,625% n=100 n=100 n=100 n=100

CONCENTRACION/AE AE Lippia origanoides Control/ agua destilada

20% n=100 n=100 n=100

10% n=100 n=100 n=100

5% n=100 n=100 n=100

2,5% n=100 n=100 n=100

1,25% n=100 n=100

0,625% n=100 n=100